ปัจจัยรบกวนในปฏิกิริยา PCR

ในระหว่างปฏิกิริยา PCR มักพบปัจจัยรบกวนบางอย่าง
เนื่องจากความไวของ PCR ที่สูงมาก การปนเปื้อนจึงถือเป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่สุดที่ส่งผลต่อผลลัพธ์ของ PCR และอาจสร้างผลบวกลวงได้
สิ่งที่สำคัญพอๆ กันคือแหล่งที่มาต่างๆ ที่นำไปสู่ผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ-ลบหากส่วนที่สำคัญอย่างน้อยหนึ่งส่วนของส่วนผสม PCR หรือปฏิกิริยาการขยายตัวเองถูกยับยั้งหรือแทรกแซง การวิเคราะห์วินิจฉัยอาจถูกขัดขวางสิ่งนี้สามารถนำไปสู่ประสิทธิภาพที่ลดลงและแม้กระทั่งผลลัพธ์เชิงลบที่ผิดพลาด
นอกจากการยับยั้งแล้ว การสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายอาจเกิดขึ้นเนื่องจากสภาวะการขนส่งและ/หรือการจัดเก็บก่อนการเตรียมตัวอย่างโดยเฉพาะอย่างยิ่ง อุณหภูมิสูงหรือการจัดเก็บที่ไม่เพียงพออาจทำให้เซลล์และกรดนิวคลีอิกเสียหายได้การตรึงเซลล์และเนื้อเยื่อและการฝังพาราฟินเป็นสาเหตุที่รู้จักกันดีของการแตกตัวของดีเอ็นเอและปัญหาที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง (ดูรูปที่ 1 และ 2)ในกรณีเหล่านี้ แม้แต่การแยกตัวและการทำให้บริสุทธิ์อย่างเหมาะสมก็ไม่สามารถช่วยได้

รูปที่ 1 |ผลของการตรึงต่อความสมบูรณ์ของ DNA
Agarose gel electrophoresis แสดงให้เห็นว่าคุณภาพของ DNA ที่แยกได้จากส่วนพาราฟินของการชันสูตรพลิกศพนั้นแตกต่างกันมากDNA ที่มีความยาวชิ้นส่วนเฉลี่ยต่างกันมีอยู่ในสารสกัดขึ้นอยู่กับวิธีการตรึงดีเอ็นเอถูกเก็บรักษาไว้เฉพาะเมื่อจับตัวอย่างแช่แข็งพื้นเมืองและฟอร์มาลินเป็นกลางบัฟเฟอร์การใช้ฟอร์มาลินที่มีส่วนผสมของกรดฟอร์มิกที่มีฤทธิ์เป็นกรดสูงหรือฟอร์มาลินที่ไม่ผ่านการบัฟเฟอร์ทำให้สูญเสีย DNA อย่างมีนัยสำคัญเศษที่เหลือมีการแยกส่วนอย่างมาก
ทางด้านซ้าย ความยาวของแฟรกเมนต์แสดงเป็นหน่วยกิโลเบสคู่ (kbp)

รูปที่ 2 |การสูญเสียความสมบูรณ์ของเป้าหมายที่เป็นกรดนิวคลีอิก
(a) ช่องว่าง 3′-5′ บนทั้งสองเส้นจะส่งผลให้ DNA เป้าหมายแตกการสังเคราะห์ DNA จะยังคงเกิดขึ้นที่ชิ้นส่วนเล็กๆอย่างไรก็ตาม หากไม่มีตำแหน่งการหลอมไพรเมอร์บนชิ้นส่วน DNA จะเกิดการขยายตัวเชิงเส้นเท่านั้นในกรณีที่ดีที่สุด ชิ้นส่วนอาจคืนสภาพซึ่งกันและกัน แต่ผลลัพธ์ที่ได้จะน้อยและต่ำกว่าระดับการตรวจจับ
(b) การสูญเสียเบส โดยส่วนใหญ่เกิดจาก depurination และการสร้าง thymidine dimer ทำให้จำนวนพันธะ H ลดลงและ Tm ลดลงในระหว่างขั้นตอนการอุ่นที่ยืดเยื้อ ไพรเมอร์จะละลายออกจากเมทริกซ์ DNA และจะไม่หลอมเหลวแม้ในสภาวะที่เข้มงวดน้อยกว่า
(c) เบสไทมีนที่อยู่ติดกันก่อตัวเป็นไดเมอร์ TT
ปัญหาทั่วไปอีกประการหนึ่งที่มักเกิดขึ้นในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลคือการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกเป้าหมายน้อยกว่าที่เหมาะสมเมื่อเทียบกับการสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์มในกรณีที่รุนแรง อาจเกี่ยวข้องกับการปฏิเสธที่ผิดพลาดสามารถประหยัดเวลาได้มากโดยการต้มสลายหรือการย่อยด้วยเอนไซม์ของเศษเซลล์ แต่วิธีนี้มักจะส่งผลให้มีความไว PCR ต่ำเนื่องจากการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกไม่เพียงพอ

การยับยั้งการทำงานของโพลีเมอเรสระหว่างการขยาย

โดยทั่วไป การยับยั้งจะใช้เป็นแนวคิดคอนเทนเนอร์เพื่ออธิบายปัจจัยทั้งหมดที่นำไปสู่ผลลัพธ์ของ PCR ที่ต่ำกว่ามาตรฐานในความหมายทางชีวเคมีอย่างเคร่งครัด การยับยั้งถูกจำกัดอยู่ที่กิจกรรมของเอนไซม์ กล่าวคือ มันลดหรือป้องกันการเปลี่ยนสารตั้งต้นของผลิตภัณฑ์ผ่านการมีปฏิสัมพันธ์กับตำแหน่งที่ทำงานอยู่ของ DNA polymerase หรือปัจจัยร่วมของมัน (เช่น Mg2+ สำหรับ Taq DNA polymerase)
ส่วนประกอบในตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์และสารสกัดต่างๆ ที่มีรีเอเจนต์สามารถยับยั้งเอนไซม์หรือดักจับปัจจัยร่วมได้โดยตรง (เช่น EDTA) ซึ่งจะทำให้โพลิเมอเรสหยุดทำงาน และส่งผลให้ผล PCR เชิงลบลดลงหรือผิดพลาด
อย่างไรก็ตาม ปฏิสัมพันธ์หลายอย่างระหว่างส่วนประกอบของปฏิกิริยากับกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายก็ถูกกำหนดให้เป็น 'สารยับยั้ง PCR' เช่นกันเมื่อความสมบูรณ์ของเซลล์ถูกทำลายโดยการแยกตัวและกรดนิวคลีอิกถูกปลดปล่อยออกมา ปฏิสัมพันธ์ระหว่างตัวอย่างกับสารละลายที่อยู่รอบๆ และเฟสของแข็งสามารถเกิดขึ้นได้ตัวอย่างเช่น 'สคาเวนเจอร์' สามารถผูกมัด DNA สายเดี่ยวหรือสายคู่ผ่านอันตรกิริยาที่ไม่ใช่โควาเลนต์ และรบกวนการแยกตัวและการทำให้บริสุทธิ์โดยลดจำนวนเป้าหมายที่จะไปถึงถังปฏิกิริยา PCR ในที่สุด
โดยทั่วไป สารยับยั้ง PCR มีอยู่ในของเหลวในร่างกายและรีเอเจนต์ส่วนใหญ่ที่ใช้สำหรับการตรวจวินิจฉัยทางคลินิก (ยูเรียในปัสสาวะ เฮโมโกลบินและเฮปารินในเลือด) ผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร (ส่วนประกอบอินทรีย์ ไกลโคเจน ไขมัน ไอออน Ca2+) และส่วนประกอบในสิ่งแวดล้อม (ฟีนอล ,โลหะหนัก)

สารยับยั้ง PCR ที่แพร่หลายมากขึ้นสามารถพบได้ในแบคทีเรียและเซลล์ยูคาริโอต, DNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย, โมเลกุลขนาดใหญ่ที่จับกับ DNA ของเมทริกซ์เนื้อเยื่อและอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ เช่น ถุงมือและพลาสติกการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ในระหว่างหรือหลังการสกัดเป็นวิธีที่แนะนำสำหรับการกำจัดสารยับยั้ง PCR
ปัจจุบัน อุปกรณ์การสกัดแบบอัตโนมัติต่างๆ สามารถแทนที่โปรโตคอลแบบแมนนวลจำนวนมาก แต่การกู้คืนและ/หรือการทำให้บริสุทธิ์ของเป้าหมายไม่เคยสำเร็จ 100%สารยับยั้งที่มีศักยภาพอาจยังคงอยู่ในกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์หรืออาจมีผลไปแล้วมีกลยุทธ์ที่แตกต่างกันเพื่อลดผลกระทบของสารยับยั้งการเลือกพอลิเมอเรสที่เหมาะสมสามารถมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อกิจกรรมของสารยับยั้งวิธีการอื่นๆ ที่ได้รับการพิสูจน์แล้วในการลดการยับยั้ง PCR คือการเพิ่มความเข้มข้นของโพลีเมอเรสหรือการใช้สารเติมแต่ง เช่น BSA
การยับยั้งปฏิกิริยา PCR สามารถแสดงให้เห็นได้โดยใช้การควบคุมคุณภาพกระบวนการภายใน (IPC)
ต้องใช้ความระมัดระวังในการขจัดรีเอเจนต์และสารละลายอื่นๆ ในชุดสกัด เช่น เอทานอล, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ไอโซโพรพานอล และฟีนอล ออกจากกรดนิวคลีอิกที่แยกออกด้วยขั้นตอนการล้างอย่างละเอียดอาจกระตุ้นหรือยับยั้ง PCR ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น