ปัจจัยรบกวนในปฏิกิริยา PCR

ในระหว่างปฏิกิริยา PCR มักพบปัจจัยรบกวนบางประการ
เนื่องจากความไวของ PCR สูงมาก การปนเปื้อนจึงถือเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดประการหนึ่งที่ส่งผลต่อผลลัพธ์ PCR และสามารถสร้างผลลัพธ์ที่เป็นบวกลวงได้
สิ่งสำคัญพอๆ กันคือแหล่งที่มาต่างๆ ที่นำไปสู่ผลลัพธ์ที่เป็นลบลวง หากมีการยับยั้งหรือแทรกแซงส่วนสำคัญของส่วนผสม PCR หรือปฏิกิริยาการขยายสัญญาณ การตรวจวินิจฉัยสามารถขัดขวางได้ สิ่งนี้สามารถนำไปสู่การลดประสิทธิภาพและแม้กระทั่งผลลัพธ์เชิงลบที่ผิดพลาด
นอกจากการยับยั้งแล้ว การสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายอาจเกิดขึ้นเนื่องจากการขนส่งและ/หรือสภาวะการเก็บรักษาก่อนการเตรียมตัวอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งอุณหภูมิสูงหรือการเก็บรักษาไม่เพียงพออาจทำให้เซลล์และกรดนิวคลีอิกเสียหายได้ การตรึงเซลล์และเนื้อเยื่อและการฝังพาราฟินเป็นสาเหตุที่รู้จักกันดีของการกระจายตัวของ DNA และปัญหาที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง (ดูรูปที่ 1 และ 2) ในกรณีเหล่านี้ แม้แต่การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดก็ไม่สามารถช่วยได้

รูปที่ 1 | ผลของการตรึงการเคลื่อนที่ต่อความสมบูรณ์ของ DNA
Agarose gel electrophoresis แสดงให้เห็นว่าคุณภาพของ DNA ที่แยกได้จากส่วนพาราฟินของการชันสูตรพลิกศพมีความแตกต่างกันอย่างมาก DNA ที่มีความยาวแฟรกเมนต์เฉลี่ยต่างกันมีอยู่ในสารสกัด ขึ้นอยู่กับวิธีการตรึง DNA จะถูกเก็บรักษาไว้ก็ต่อเมื่อตรึงไว้ในตัวอย่างแช่แข็งตามธรรมชาติและในฟอร์มาลินที่เป็นกลางซึ่งมีบัฟเฟอร์ การใช้ฟอร์มาลินที่มีกรดฟอร์มิกที่มีกรดฟอร์มิกเป็นกรดจัดหรือไม่มีบัฟเฟอร์ ส่งผลให้สูญเสีย DNA อย่างมีนัยสำคัญ เศษส่วนที่เหลือมีการแยกส่วนอย่างมาก
ทางด้านซ้าย ความยาวของแฟรกเมนต์จะแสดงเป็นคู่กิโลเบส (kbp)

รูปที่ 2 | การสูญเสียความสมบูรณ์ของเป้าหมายกรดนิวคลีอิก
(a) ช่องว่าง 3′-5′ บนทั้งสองเส้นจะส่งผลให้ DNA เป้าหมายแตกหัก การสังเคราะห์ DNA จะยังคงเกิดขึ้นที่ชิ้นส่วนเล็กๆ อย่างไรก็ตาม หากตำแหน่งการหลอมด้วยไพรเมอร์หายไปในส่วน DNA จะเกิดเฉพาะการขยายเชิงเส้นเท่านั้น ในกรณีที่ดีที่สุด ชิ้นส่วนอาจคืนสภาพให้กันและกัน แต่ผลผลิตที่ได้จะน้อยและต่ำกว่าระดับการตรวจจับ
(b) การสูญเสียเบส สาเหตุหลักมาจากการทำให้บริสุทธิ์และการก่อตัวของไทมิดีนไดเมอร์ ส่งผลให้จำนวนพันธะ H ลดลงและ Tm ลดลง ในระหว่างขั้นตอนการให้ความร้อนที่ยืดเยื้อ ไพรเมอร์จะละลายออกจากเมทริกซ์ DNA และจะไม่หลอมเหลวแม้ภายใต้สภาวะที่เข้มงวดน้อยกว่า
(c) ฐานไทมีนที่อยู่ติดกันก่อให้เกิดไดเมอร์ TT
ปัญหาทั่วไปอีกประการหนึ่งที่มักเกิดขึ้นในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลคือการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกเป้าหมายได้น้อยกว่าที่เหมาะสมที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับการสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์ม ในกรณีที่ร้ายแรง สิ่งนี้สามารถเชื่อมโยงกับผลลบลวงได้ สามารถประหยัดเวลาได้มากโดยการเดือดสลายหรือการย่อยด้วยเอนไซม์ของเศษเซลล์ แต่วิธีนี้มักส่งผลให้มีความไว PCR ต่ำเนื่องจากมีการปล่อยกรดนิวคลีอิกไม่เพียงพอ

การยับยั้งการทำงานของโพลีเมอเรสระหว่างการขยาย

โดยทั่วไป การยับยั้งจะใช้เป็นแนวคิดในคอนเทนเนอร์เพื่ออธิบายปัจจัยทั้งหมดที่นำไปสู่ผลลัพธ์ PCR ที่ต่ำกว่ามาตรฐาน ในแง่ชีวเคมีอย่างเคร่งครัด การยับยั้งจะจำกัดอยู่เพียงกิจกรรมของเอนไซม์ กล่าวคือ จะลดหรือป้องกันการเปลี่ยนแปลงของสารตั้งต้น-ผลิตภัณฑ์ผ่านการมีปฏิสัมพันธ์กับตำแหน่งที่ทำงานของ DNA polymerase หรือโคแฟกเตอร์ของมัน (เช่น Mg2+ สำหรับ Taq DNA polymerase)
ส่วนประกอบในตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์และสารสกัดต่างๆ ที่มีรีเอเจนต์สามารถยับยั้งเอนไซม์ได้โดยตรงหรือดักจับโคแฟกเตอร์ของเอนไซม์ (เช่น EDTA) ซึ่งจะทำให้โพลีเมอเรสหยุดทำงาน และส่งผลให้ PCR เป็นลบลดลงหรือเป็นลบลวง
อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาหลายอย่างระหว่างส่วนประกอบของปฏิกิริยาและกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายยังถูกกำหนดให้เป็น 'สารยับยั้ง PCR' อีกด้วย เมื่อความสมบูรณ์ของเซลล์ถูกรบกวนโดยการแยกตัวและกรดนิวคลีอิกถูกปล่อยออกมา ปฏิกิริยาระหว่างตัวอย่างกับสารละลายโดยรอบและเฟสของแข็งก็สามารถเกิดขึ้นได้ ตัวอย่างเช่น 'สัตว์เก็บขยะ' สามารถจับ DNA แบบเดี่ยวหรือแบบคู่ผ่านปฏิกิริยาที่ไม่ใช่โควาเลนต์ และรบกวนการแยกตัวและการทำให้บริสุทธิ์โดยการลดจำนวนเป้าหมายที่จะไปถึงถังปฏิกิริยา PCR ในที่สุด
โดยทั่วไป สารยับยั้ง PCR มีอยู่ในของเหลวในร่างกายและรีเอเจนต์ส่วนใหญ่ที่ใช้ในการทดสอบวินิจฉัยทางคลินิก (ยูเรียในปัสสาวะ ฮีโมโกลบิน และเฮปารินในเลือด) ผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร (ส่วนประกอบอินทรีย์ ไกลโคเจน ไขมัน ไอออน Ca2+) และส่วนประกอบในสิ่งแวดล้อม (ฟีนอล , โลหะหนัก)

สารยับยั้ง PCR ที่แพร่หลายมากขึ้นสามารถพบได้ในแบคทีเรียและเซลล์ยูคาริโอต, DNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย, โมเลกุลขนาดใหญ่ที่จับ DNA ของเมทริกซ์เนื้อเยื่อ และอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ เช่น ถุงมือและพลาสติก การทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ในระหว่างหรือหลังการสกัดเป็นวิธีที่แนะนำในการกำจัดสารยับยั้ง PCR
ในปัจจุบัน อุปกรณ์สกัดแบบอัตโนมัติต่างๆ สามารถแทนที่โปรโตคอลแบบแมนนวลได้หลายแบบ แต่การกู้คืนและ/หรือการทำให้เป้าหมายบริสุทธิ์ 100% ไม่เคยทำได้สำเร็จเลย สารยับยั้งที่มีศักยภาพอาจยังคงอยู่ในกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์หรืออาจออกฤทธิ์ไปแล้ว มีกลยุทธ์ที่แตกต่างกันเพื่อลดผลกระทบของสารยับยั้ง การเลือกโพลีเมอเรสที่เหมาะสมสามารถมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการออกฤทธิ์ของสารยับยั้ง วิธีการอื่นๆ ที่ได้รับการพิสูจน์แล้วในการลดการยับยั้ง PCR คือการเพิ่มความเข้มข้นของโพลีเมอเรสหรือการใช้สารเติมแต่ง เช่น BSA
การยับยั้งปฏิกิริยา PCR สามารถแสดงให้เห็นได้โดยใช้การควบคุมคุณภาพกระบวนการภายใน (IPC)
ต้องใช้ความระมัดระวังในการขจัดรีเอเจนต์และสารละลายอื่นๆ ทั้งหมดในชุดสกัด เช่น เอทานอล, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ไอโซโพรพานอล และฟีนอล ออกจากกรดนิวคลีอิกที่แยกได้โดยขั้นตอนการล้างอย่างละเอียด อาจกระตุ้นหรือยับยั้ง PCR ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น