ปัจจัยการรบกวนในปฏิกิริยา PCR

ในระหว่างปฏิกิริยา PCR มักพบปัจจัยรบกวนบางอย่าง
เนื่องจากความไวสูงมากของ PCR การปนเปื้อนจึงถือเป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่สุดที่มีผลต่อผลลัพธ์ของ PCR และสามารถสร้างผลลัพธ์ที่ผิดพลาดได้
ความสำคัญอย่างเท่าเทียมกันคือแหล่งต่าง ๆ ที่นำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด หากส่วนที่สำคัญอย่างน้อยหนึ่งส่วนของส่วนผสม PCR หรือปฏิกิริยาการขยายตัวนั้นถูกยับยั้งหรือแทรกแซงด้วยการทดสอบการวินิจฉัยสามารถถูกขัดขวางได้ สิ่งนี้สามารถนำไปสู่ประสิทธิภาพที่ลดลงและแม้กระทั่งผลลัพธ์เชิงลบที่ผิดพลาด
นอกเหนือจากการยับยั้งการสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายอาจเกิดขึ้นเนื่องจากการจัดส่งและ/หรือเงื่อนไขการจัดเก็บก่อนการเตรียมตัวอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งอุณหภูมิสูงหรือการจัดเก็บที่ไม่เพียงพออาจนำไปสู่ความเสียหายของเซลล์และกรดนิวคลีอิก การตรึงเซลล์และเนื้อเยื่อและการฝังพาราฟินเป็นสาเหตุที่รู้จักกันดีของการกระจายตัวของดีเอ็นเอและปัญหาถาวร (ดูรูปที่ 1 และ 2) ในกรณีเหล่านี้การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ที่ดีที่สุดจะไม่ช่วย

รูปที่ 1 | ผลของการตรึงต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ
agarose gel electrophoresis แสดงให้เห็นว่าคุณภาพของ DNA ที่แยกได้จากส่วนพาราฟินของการชันสูตรพลิกศพแตกต่างกันมาก DNA ของความยาวส่วนเฉลี่ยที่แตกต่างกันมีอยู่ในสารสกัดขึ้นอยู่กับวิธีการตรึง DNA ได้รับการเก็บรักษาไว้เฉพาะเมื่อคงที่ในตัวอย่างแช่แข็งดั้งเดิมและในฟอร์มาลินที่เป็นกลางบัฟเฟอร์ การใช้การตรึง Bouin ที่เป็นกรดอย่างมากหรือไม่บัดนี้ฟอร์มาลินที่มีกรดฟอร์มิกทำให้เกิดการสูญเสีย DNA อย่างมีนัยสำคัญ ส่วนที่เหลือมีการแยกส่วนอย่างมาก
ทางด้านซ้ายความยาวของชิ้นส่วนจะแสดงเป็นกิโลกรัมคู่ (kbp)

รูปที่ 2 | การสูญเสียความสมบูรณ์ของเป้าหมายกรดนิวคลีอิก
(a) ช่องว่าง 3′-5 ′ของทั้งสองเส้นจะส่งผลให้เกิดการหยุดพักใน DNA เป้าหมาย การสังเคราะห์ DNA จะยังคงเกิดขึ้นในชิ้นส่วนเล็ก ๆ อย่างไรก็ตามหากไซต์การอบอ่อนไพรเมอร์หายไปในชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะมีเพียงการขยายเชิงเส้นเท่านั้น ในกรณีที่เอื้ออำนวยที่สุดชิ้นส่วนอาจกลับมาอีกครั้ง แต่ผลผลิตจะมีขนาดเล็กและต่ำกว่าระดับการตรวจจับ
(b) การสูญเสียฐานส่วนใหญ่เกิดจากการ depurination และการก่อตัวของ thymidine dimer นำไปสู่การลดลงของจำนวนพันธะ H และการลดลงของ TM ในช่วงความร้อนที่ยาวนานไพรเมอร์จะละลายออกไปจาก DNA เมทริกซ์และจะไม่หลอมแม้ภายใต้สภาวะที่เข้มงวดน้อยกว่า
(c) ฐาน thymine ที่อยู่ติดกันก่อตัวเป็น TT dimer
ปัญหาที่พบบ่อยอีกประการหนึ่งที่มักเกิดขึ้นในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลคือการปล่อยกรดนิวคลีอิกเป้าหมายน้อยกว่าที่ดีที่สุดเมื่อเทียบกับการสกัดฟีนอลคลอโรฟอร์ม ในกรณีที่รุนแรงสิ่งนี้สามารถเชื่อมโยงกับเชิงลบที่ผิดพลาด สามารถประหยัดเวลาได้มากโดยการสลาย lysis หรือการย่อยของเอนไซม์ของเศษเซลล์ แต่วิธีนี้มักจะส่งผลให้ความไวของ PCR ต่ำเนื่องจากการปล่อยกรดนิวคลีอิกไม่เพียงพอ

การยับยั้งกิจกรรมโพลีเมอเรสในระหว่างการขยาย

โดยทั่วไปการยับยั้งจะใช้เป็นแนวคิดคอนเทนเนอร์เพื่ออธิบายปัจจัยทั้งหมดที่นำไปสู่ผลลัพธ์ PCR ที่ไม่ดี ในความหมายทางชีวเคมีอย่างเคร่งครัดการยับยั้งจะ จำกัด เฉพาะกิจกรรมของเอนไซม์เช่นมันจะลดหรือป้องกันการแปลงผลิตภัณฑ์สารตั้งต้นผ่านการมีปฏิสัมพันธ์กับไซต์ที่ใช้งานของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสหรือโคแฟคเตอร์ (เช่น Mg2+ สำหรับ TAQ DNA polymerase)
ส่วนประกอบในตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์และสารสกัดต่าง ๆ ที่มีรีเอเจนต์สามารถยับยั้งเอนไซม์โดยตรงหรือดักจับ cofactors (เช่น EDTA) ดังนั้นจึงหยุดการทำงานของพอลิเมอเรสและนำไปสู่ผลลัพธ์ PCR เชิงลบที่ลดลงหรือผิดพลาด
อย่างไรก็ตามการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างส่วนประกอบปฏิกิริยาและกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายนั้นถูกกำหนดให้เป็น 'PCR inhibitors' เมื่อความสมบูรณ์ของเซลล์ถูกรบกวนโดยการแยกและกรดนิวคลีอิกจะถูกปล่อยออกมาการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างตัวอย่างและสารละลายโดยรอบและเฟสของแข็งสามารถเกิดขึ้นได้ ตัวอย่างเช่น 'scavengers' สามารถผูก DNA เดี่ยวหรือสองเส้นผ่านการโต้ตอบที่ไม่ใช่โควาเลนต์และรบกวนการแยกและการทำให้บริสุทธิ์โดยการลดจำนวนเป้าหมายที่ในที่สุดก็ไปถึงภาชนะปฏิกิริยา PCR
โดยทั่วไปแล้วสารยับยั้ง PCR มีอยู่ในของเหลวในร่างกายและรีเอเจนต์ส่วนใหญ่ที่ใช้สำหรับการทดสอบการวินิจฉัยทางคลินิก (ยูเรียในปัสสาวะ, ฮีโมโกลบินและเฮปารินในเลือด), อาหารเสริมอาหาร (ส่วนประกอบอินทรีย์, ไกลโคเจน, ไขมัน, CA2+ ไอออน)

สารยับยั้ง PCR ที่แพร่หลายมากขึ้นสามารถพบได้ในแบคทีเรียและเซลล์ยูคาริโอต, DNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย, macromolecules ที่จับกับดีเอ็นเอของเมทริกซ์เนื้อเยื่อและอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการเช่นถุงมือและพลาสติก การทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกในระหว่างหรือหลังการสกัดเป็นวิธีที่ต้องการในการกำจัดสารยับยั้ง PCR
วันนี้อุปกรณ์สกัดอัตโนมัติต่างๆสามารถแทนที่โปรโตคอลด้วยตนเองจำนวนมาก แต่การกู้คืน 100% และ/หรือการทำให้บริสุทธิ์ของเป้าหมายไม่เคยประสบความสำเร็จ สารยับยั้งที่มีศักยภาพอาจยังคงอยู่ในกรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์หรืออาจมีผลแล้ว มีกลยุทธ์ที่แตกต่างกันเพื่อลดผลกระทบของสารยับยั้ง ทางเลือกของโพลีเมอเรสที่เหมาะสมอาจมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อกิจกรรมยับยั้ง วิธีการอื่นที่พิสูจน์แล้วเพื่อลดการยับยั้ง PCR คือการเพิ่มความเข้มข้นของโพลีเมอเรสหรือการใช้สารเติมแต่งเช่น BSA
การยับยั้งปฏิกิริยา PCR สามารถแสดงให้เห็นได้โดยการใช้การควบคุมคุณภาพกระบวนการภายใน (IPC)
ต้องใช้ความระมัดระวังในการลบรีเอเจนต์ทั้งหมดและโซลูชั่นอื่น ๆ ในชุดสกัดเช่นเอทานอล, EDTA, Cetab, LICL, GUSCN, SDS, Isopropanol และฟีนอลจากกรดนิวคลีอิกแยกโดยขั้นตอนการล้างอย่างละเอียด ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของพวกเขาพวกเขาอาจเปิดใช้งานหรือยับยั้ง PCR