ปัจจัยรบกวนในปฏิกิริยา PCR

ในระหว่างปฏิกิริยา PCR มักพบปัจจัยแทรกแซงบางประการ
เนื่องจาก PCR มีความไวสูงมาก การปนเปื้อนจึงถือเป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่สุดที่ส่งผลต่อผล PCR และอาจทำให้เกิดผลบวกปลอมได้
ปัจจัยสำคัญที่มีความสำคัญไม่แพ้กันคือแหล่งที่มาต่างๆ ที่นำไปสู่ผลลบลวง หากส่วนประกอบสำคัญอย่างน้อยหนึ่งส่วนของส่วนผสม PCR หรือปฏิกิริยาการขยายสัญญาณถูกยับยั้งหรือรบกวน การตรวจวินิจฉัยอาจถูกขัดขวาง ซึ่งอาจนำไปสู่ประสิทธิภาพที่ลดลงและอาจถึงขั้นให้ผลลบลวงได้
นอกจากการยับยั้งแล้ว การสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายอาจเกิดขึ้นเนื่องจากสภาวะการขนส่งและ/หรือการจัดเก็บก่อนการเตรียมตัวอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อุณหภูมิสูงหรือการจัดเก็บที่ไม่เพียงพออาจนำไปสู่ความเสียหายของเซลล์และกรดนิวคลีอิก การตรึงเซลล์และเนื้อเยื่อและการฝังพาราฟินเป็นสาเหตุที่ทราบกันดีของการแตกตัวของดีเอ็นเอและเป็นปัญหาที่คงอยู่ (ดูรูปที่ 1 และ 2) ในกรณีเหล่านี้ แม้แต่การแยกและการทำให้บริสุทธิ์อย่างเหมาะสมที่สุดก็ไม่สามารถช่วยได้

รูปที่ 1 | ผลของการตรึงต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ
การวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟรีซิสด้วยเจลอะกาโรสแสดงให้เห็นว่าคุณภาพของดีเอ็นเอที่แยกได้จากชิ้นส่วนพาราฟินจากการชันสูตรศพมีความแตกต่างกันอย่างมาก ดีเอ็นเอที่มีความยาวชิ้นส่วนเฉลี่ยต่างกันจะพบในสารสกัดขึ้นอยู่กับวิธีการตรึง ดีเอ็นเอจะถูกเก็บรักษาไว้เฉพาะเมื่อตรึงในตัวอย่างแช่แข็งดั้งเดิมและในฟอร์มาลินที่เป็นกลางที่บัฟเฟอร์แล้ว การใช้สารตรึง Bouin ที่เป็นกรดเข้มข้นหรือฟอร์มาลินที่ประกอบด้วยกรดฟอร์มิกแบบไม่มีบัฟเฟอร์ส่งผลให้ดีเอ็นเอสูญเสียไปอย่างมีนัยสำคัญ ส่วนที่เหลือมีชิ้นส่วนที่แตกหักจำนวนมาก
ทางด้านซ้ายความยาวของชิ้นส่วนแสดงเป็นกิโลเบสคู่ (kbp)

รูปที่ 2 | การสูญเสียความสมบูรณ์ของเป้าหมายกรดนิวคลีอิก
(ก) ช่องว่าง 3′-5′ บนสายทั้งสองจะส่งผลให้ดีเอ็นเอเป้าหมายขาด การสังเคราะห์ดีเอ็นเอจะยังคงเกิดขึ้นบนชิ้นส่วนขนาดเล็ก อย่างไรก็ตาม หากตำแหน่งการอบอ่อนไพรเมอร์บนชิ้นส่วนดีเอ็นเอหายไป จะเกิดการขยายแบบเชิงเส้นเท่านั้น ในกรณีที่เหมาะสมที่สุด ชิ้นส่วนดีเอ็นเออาจอิ่มตัวซึ่งกันและกัน แต่ผลผลิตจะน้อยและต่ำกว่าระดับการตรวจจับ
(b) การสูญเสียเบส ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการดีเพียวริเนชันและการเกิดไดเมอร์ไทมิดีน นำไปสู่การลดลงของจำนวนพันธะไฮโดรเจนและ Tm ที่ลดลง ในระหว่างช่วงการอุ่นแบบยืดออก ไพรเมอร์จะละลายออกจากดีเอ็นเอของเมทริกซ์และจะไม่เกิดการอบอ่อนแม้ในสภาวะที่ไม่เข้มงวดมากนัก
(c) เบสไทมีนที่อยู่ติดกันก่อตัวเป็นไดเมอร์ TT
ปัญหาที่พบบ่อยอีกประการหนึ่งที่มักเกิดขึ้นในการวินิจฉัยทางโมเลกุลคือการปล่อยกรดนิวคลีอิกเป้าหมายที่ไม่เหมาะสมเมื่อเทียบกับการสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์ม ในกรณีรุนแรง อาจทำให้เกิดผลลบลวงได้ การต้มไลซิสหรือการย่อยเศษเซลล์ด้วยเอนไซม์สามารถประหยัดเวลาได้มาก แต่วิธีนี้มักทำให้ความไวของ PCR ต่ำเนื่องจากการปล่อยกรดนิวคลีอิกไม่เพียงพอ

การยับยั้งกิจกรรมของโพลีเมอเรสในระหว่างการขยายสัญญาณ

โดยทั่วไป การยับยั้งถูกใช้เป็นแนวคิดหลักในการอธิบายปัจจัยทั้งหมดที่นำไปสู่ผลลัพธ์ PCR ที่ต่ำกว่ามาตรฐาน ในแง่ชีวเคมี การยับยั้งจำกัดอยู่เพียงกิจกรรมของเอนไซม์ กล่าวคือ ยับยั้งการลดหรือป้องกันการเปลี่ยนสารตั้งต้นเป็นผลิตภัณฑ์ผ่านปฏิกิริยากับบริเวณแอคทีฟไซต์ของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสหรือโคแฟกเตอร์ (เช่น Mg2+ สำหรับดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Taq)
ส่วนประกอบในตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์และสารสกัดต่างๆ ที่มีรีเอเจนต์สามารถยับยั้งเอนไซม์โดยตรงหรือดักจับโคแฟกเตอร์ของเอนไซม์ (เช่น EDTA) ส่งผลให้โพลิเมอเรสไม่ทำงาน และทำให้ผล PCR ลดลงหรือเป็นผลลบปลอม
อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาหลายอย่างระหว่างส่วนประกอบของปฏิกิริยากับกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายก็ถูกเรียกว่า "สารยับยั้ง PCR" เช่นกัน เมื่อความสมบูรณ์ของเซลล์ถูกทำลายจากการแยกตัวและกรดนิวคลีอิกถูกปลดปล่อยออกมา ปฏิกิริยาระหว่างตัวอย่างกับสารละลายและเฟสแข็งโดยรอบอาจเกิดขึ้นได้ ตัวอย่างเช่น "สารกำจัด" สามารถจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยวหรือสายคู่ผ่านปฏิกิริยาแบบไม่มีโควาเลนต์ และรบกวนการแยกและการทำให้บริสุทธิ์โดยการลดจำนวนเป้าหมายที่จะไปถึงภาชนะปฏิกิริยา PCR ในที่สุด
โดยทั่วไปสารยับยั้ง PCR พบได้ในของเหลวในร่างกายส่วนใหญ่และสารเคมีที่ใช้ในการทดสอบวินิจฉัยทางคลินิก (ยูเรียในปัสสาวะ ฮีโมโกลบินและเฮปารินในเลือด) อาหารเสริม (ส่วนประกอบอินทรีย์ ไกลโคเจน ไขมัน ไอออน Ca2+) และส่วนประกอบในสิ่งแวดล้อม (ฟีนอล โลหะหนัก)

สารยับยั้ง PCR ที่พบได้บ่อยกว่าสามารถพบได้ในแบคทีเรียและเซลล์ยูคาริโอต ดีเอ็นเอที่ไม่ใช่เป้าหมาย โมเลกุลขนาดใหญ่ที่จับกับดีเอ็นเอของเนื้อเยื่อ และอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ เช่น ถุงมือและพลาสติก การทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ระหว่างหรือหลังการสกัดเป็นวิธีที่นิยมใช้ในการกำจัดสารยับยั้ง PCR
ปัจจุบัน อุปกรณ์สกัดอัตโนมัติหลายชนิดสามารถทดแทนโปรโตคอลแบบใช้มือได้มากมาย แต่ยังไม่เคยสามารถกู้คืนและ/หรือทำให้บริสุทธิ์เป้าหมายได้ 100% สารยับยั้งที่มีศักยภาพอาจยังคงอยู่ในกรดนิวคลีอิกที่บริสุทธิ์แล้ว หรืออาจออกฤทธิ์ไปแล้ว มีกลยุทธ์ต่างๆ เพื่อลดผลกระทบของสารยับยั้ง การเลือกพอลิเมอเรสที่เหมาะสมสามารถส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการทำงานของสารยับยั้ง วิธีการอื่นๆ ที่ได้รับการพิสูจน์แล้วในการลดการยับยั้ง PCR ได้แก่ การเพิ่มความเข้มข้นของพอลิเมอเรส หรือการใช้สารเติมแต่ง เช่น BSA
การยับยั้งปฏิกิริยา PCR สามารถแสดงให้เห็นได้โดยการใช้การควบคุมคุณภาพกระบวนการภายใน (IPC)
ต้องระมัดระวังในการแยกสารรีเอเจนต์และสารละลายอื่นๆ ในชุดสกัด เช่น เอทานอล EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ไอโซโพรพานอล และฟีนอล ออกจากสารสกัดกรดนิวคลีอิกด้วยขั้นตอนการล้างให้สะอาด สารเหล่านี้อาจกระตุ้นหรือยับยั้ง PCR ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น